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常用的组织固定液

固定剂是一种化学试剂,有液体和固体之分,一般使用较多的是液体,而固体固定剂如多聚甲醛,则多用于实验研究的组织固定。固定剂的种类繁多,成份复杂,对组织的作用不尽相同,英国著名的组织化学专家Pearse指出:对于每个既定的组织化学方法来说,选择最合适的方法是极为重要:在组织化学研究准备阶段不论采用什么固定剂,都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分的反应基团的效用。

常用的固定液分两类,一类是以单一化学物质配成的固定液,称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液,称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、 Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此,选择合适的固定液是达到固定目的的基础。

(1)4%甲醛-PBS:甲醛是一种气体,其饱和水溶液无色,约含40%甲醛。在很多情况下,甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。4%甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快,并能较好地保存组织的外部形式,固定效果不受制片影响,固定材料可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强,对组织固定均匀,能增强组织的弹性,大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液,在冷冻切片中,甲醛作固定剂具有显著的优点。用40%甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。

(2)丙酮:丙酮为无色易挥发液体,用纯冷丙酮(4℃)固定细胞内酶效果较佳。

(3)乙醇:乙醇又称酒精,固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液。乙醇除有固定作用外,还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的适宜浓度为70%~100%。乙醇的缺点是渗透力差,并使组织收缩。

(4)醋酸:常用0.3%~5%浓度的醋酸作固定剂。醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合,醋酸不固定蛋白质,但能固定核酸。醋酸的穿透力很大,它对细胞的膨胀作用显著,这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合,所以,常用醋酸来减少其他固定剂引起的细胞收缩。细胞学技术中,它能防止细胞收缩,并能较好地保存染色体,还能把染色质沉淀成为可染色的块状体。

(5)苦味酸:苦味酸是黄色结晶体,强酸,可溶于水、乙醇、苯和二甲苯,在水中的溶解度可因水温变化而变化。苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢,单独使用时,造成组织严重收缩。它和其他药物混合配制时,可以作为蛋白质的沉淀剂,同时可避免组织收缩、硬化,而且易于染色。所以在很多混合固定液中被广泛采用。作固定用的最适浓度为1%。

(6)锇酸(四氧化锇):锇酸是一种强氧化剂,不能同乙醇和甲醛混合使用。它的挥发性很强,挥发出来的气体能固定结膜,对眼睛很有害,所以操作时应特别注意。四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一,配制时先在棕色试剂瓶中盛入50~100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0~7.4),再将装有1g锇酸的安培瓶放人PBS中,以玻棒击碎安培瓶,摇荡使锇酸溶解,备用。常用的固定液浓度为1%~2%。

(7)戊二醛:戊二醛对组织的渗透率高,与蛋白质反应快,能较好地保存蛋白质,对微管和膜性结构保存亦比较好,并能较好地保存糖原。

Ph7.2的0.1mol/L磷酸缓冲液(ml) 96 96 92 90 88
25%戊二醛水溶液(ml) 4 6 8 10 12
戊二醛的终浓度 1% 1.5% 2% 2.5% 3%

 

(8)甲醇/醋酸固定液:甲醇:醋酸为3:1的固定液是应用最广的一种培养细胞固定剂。甲醇穿透力好,醋酸固定蛋白效果好,两者结合,能使固定细胞形态不变。不仅最适用于固定染色体,而且固定的染色体适于Giemsa染色(注意:此固定液宜现用现配)。

(9)FAA固定液:此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞,固定效果好。 配制方法:90ml 80%酒精中加5ml冰乙酸和5m140%甲醛。

(10)Carnoy固定液:Carnoy固定液是较好的非水溶性固定液,是显示细胞化学成分(如粘多糖等)时常用的固定剂,固定、保真效果好,但穿透力差,适于固定培养的单层细胞。配制方法:60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸。

(11)Bouin固定液:用于固定双盖片法培养的标本,固定30分钟后,用70%酒精褪去苦味酸黄色,如不立即染色,可将标本保存在70%酒精中。本试剂适于固定组织细胞的糖原。配制方法:先将75ml饱和苦味酸(100ml水中加1.2~1.4g)过滤,加入25ml福尔马林(40%甲醛,有沉淀时禁用),最后加入5ml冰醋酸,混和后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。该固定液对组织细胞穿透力较强,固定效果较好,保存的细胞结构完好。但因偏酸(pH为 3~3.5),对抗原有一定损害。

(12)4%多聚甲醛-PBS固定液:多聚甲醛为白色固体,在50ml蒸馏水中加入4g多聚甲醛,加热至60~70℃时,边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH,至液体清晰透明。用1mol/LHCl调节pH 至7.4,冷却后加入 0.01mol/LPBS液至100ml,4℃保存。本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白。

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